Difference between revisions of "Skeletal muscle specific signalling pathways"

Revision as of 18:47, 10 March 2021

Данные по по изменению генной экспрессии в скелетных мышцах крысы (CAGE) - исследования с вывешиванием крыс за хвост в течение 7 дней и последующим периодом реадаптации (7 дней) к нормальному уровню двигательной активности (моделирование эффектов резкого снижения мышечной активности и последующей реадаптации). Для детальной оценки динамики молекулярных изменений было проведено взятие образцов мышц (m. soleus и m. extensor digitorum longus) через 12 ч, 24 ч, 3 суток и 7 суток после начала мышечной разгрузки и начала реадаптации к нормальному уровню двигательной активности.

Выделение скоординировано регулируемых групп генов (кластеров) в скелетных мышцах крыс при атрофической разгрузке и реадаптации

Кластеры скоординированно регулируемых генов определялись по экспрессии их промоторов при помощи алгоритма “китайского ресторана” (Qin, 2006), реализованного в платформе BioUML.

Данные по каждому типу мышц (m. soleus и m. extensor digitorum longus) анализировали независимо.

В результате было выделено по 15 кластеров скоординированно регулируемых генов (табл. 1.3). Для получения статистически значимых результатов в анализ включали кластеры размером не менее 100 генов.

Выделение ключевых молекул: мастер-регуляторов генной экспрессии

На следующем этапе работы были идентифицированы мастер-регуляторы, регулирующие активацию выявленных сигнальных путей в скелетных мышцах при разгрузке и при реадаптации к нормальному уровню двигательной активности (табл. 1.4). Для этого был применен метод поиска сигнальных молекул - мастер-регуляторов (Koschmann et al., 2015), как было описано выше.

Построение возможных путей передачи сигнала в клетке, вовлекающих в себя выявленные транскрипционные факторы и мастер-регуляторы

На основе выявленных мастер-регуляторов групп скоординированно экспрессированных генов были найдены пути передачи клеточного сигнала, активность которых специфична для клеток мышц, при разгрузке и при реадаптации к нормальному уровню двигательной активности. Для этого к выявленным транскрипционным факторам и мастер-регуляторам был применен метод статистического обогащения биомолекул аннотациями из базы сигнальных путей TRANSPATH.

В число сигнальных путей, активируемых при вывешивании и при восстановлении после него входили: дегенерация мышц с участием γ-секретазы (Rosa de Andrade et al, 2018), восстановление нормального фенотипа при дистрофии с участием белка Jagged1 (Vieira et al, 2015), активация синапсов при мышечном сокращении через сигнальный путь BDNF/TrkB (Hurtado et al, 2017) и активация нервной ткани при адаптации скелетной мускулатуры через сигнальный путь NGF-TrkA (Tomlinson et al, 2017) (табл. 1.3)

Выделение и анализ регуляторных районов генов, с индуцибельными альтернативными промоторами

Альтернативные промоторы, индуцибельные в клетках мышечной ткани в условиях реадаптации после вывешивания, были определены в результате кластеризации стартов транскрипции эксперимента CAGE алгоритмом DPI1 (Forrest et al, 2014), с использованием робастных порогов (на старт транскрипции приходится не менее 11 прочтений и его TPM-нормированный скор не менее 1), и выделения уникальных промоторов в сравнении с промоторами генома крысы, определенными в ходе проекта FANTOM5.

Всего в результате анализа данных эксперимента CAGE по реадаптации крыс после вывешивания было найдено 34644 промоторов в мышце длинного разгибателя пальцев (m. extensor digitorum longus), 14187 из которых пересекались с промоторами генома крысы из проекта FANTOM5 (найденными в различных тканях крысы в базальном состоянии), а 20457 - были уникальными для клеток m. extensor digitorum longus (обнаружены в нашем эксперименте) (рис. 1.2).

Рис. 1.2. Сопоставление промоторов, обнаруженных в нашем исследовании в m. extensor digitorum longus крысы (показано красным), с промоторами, аннотированных для генома крысы в проекте FANTOM5 (суммарные данные по разным тканям, показано синим).

Также было найдено 40632 промотора, в камбаловидной мышцы (m. soleus), 15585 из которых пересекались с промоторами генома крысы из проекта FANTOM5 (найденными в различных тканях крысы в базальном состоянии), а 25458 - были уникальными для клеток m. soleus (обнаружены в нашем эксперименте) (рис. 1.3)

Рис. 1.3. Сопоставление промоторов, обнаруженных в нашем исследовании в m. soleus крысы (показано красным), с промоторами, аннотированных для генома крысы в проекте FANTOM5 (суммарные данные по разным тканям, показано синим).

В промоторах активных при реадаптации в мышцах m. extensor digitorum longus и m. soleus были найдены сайты связывания транскрипционных факторов, с использованием базы данных TRANSFAC, статистически значимо обогащенные по сравнению с сайтами, найденными в промоторах, представленные в базе FANTOM5.

В силу недостаточной аннотации генома крысы (по сравнению с геном человека), найденные мотивы сайтов были аннотированы ортологичными генами человека (табл. 1.5 и 1.6)

Функциональная аннотация найденных факторов транскрипции проводилась с помощью анализа обогащения по базе данных TRANSPATH (табл. 1.7 и 1.8).

В результате анализа обогащения новых индуцибельных промоторов в m. extensor digitorum longus крысы, активированных при реадаптации после вывешивания, были выявлены процессы ассоциированные с сигнальным путем аполипопротеина E (apoE) (Kang et al, 2008), активированным оксистеролом, а также с транспортом липидов, активируемым печеночным рецептором X (LXR ) (Archer et al, 2014).

В результате анализа обогащения новых индуцибельных промоторов в m. soleus крысы, активированных при реадаптации после вывешивания, были выявлены сигнальные пути ядерного фактора активированных T-клеток NFAT5, управляющие миграцией и дифференцировкой миобластов при регенерации скелетных мышц [O'Connor et al, 2007].

Всего в мышцах m. extensor digitorum longus и m. soleus при реадаптации было активно 46923 промотора, большинство которых - 29510 - были активны в обеих мышцах. Интересно, что количество промоторов, активных только в камбаловидной мышце (11880) более чем в два раза превышало количество промоторов, активных только в разгибателе пальцев (5533) (рис. 1.4)

300px|Skeletal human - Figure 1.4

Рис. 1.4. Сопоставление промоторов, обнаруженных в нашем исследовании в m. soleus крысы (показано красным), с промоторами обнаруженными в нашем исследовании в m.extensor digitorum longus (показано синим).